免疫周3班尤晓昕结课综述：一个更有效的阻止细胞凋亡的药理学方法
华山论剑
西 北 农 林 科 技 大 学
本 科 生 课 程 考 试 试 卷 封 面
（课程名称： 免疫学与生物药物学 ）
学位课□ 选修课√ 补修课□
本科生年级、姓名、学号 尤晓昕 2017014290
所在教学班、课程号 2班每周三11～12节、2160406
本人课堂序号（1-24） 9
所 在 学 院 及 专 业 化学与药学院 化生1702
任 课 教 师 姓 名 张德礼
考 试 日 期
考 试 成 绩
评 卷 教 师 签 字 处
西北农林科技大学本科生课程考试试题
（2019 ----2020 学年第 1 学期 ）
考核对象 全校本科生
课程名称 免疫学与生物药物学 考试方式 开卷
命题教师 张德礼
考试时间 2010 年 12月 21日至 12月23日
华山论剑
综述
一个更有效的阻止细胞凋亡的药理学方法
关键字：内源性凋亡、抗凋亡抑制剂、BAX/bak、
概要：用小分子激活内源性凋亡途径是目前临床上有效的肿瘤治疗方法。但是在疾病环境中阻止细胞凋亡以防止健康细胞死亡还没有实现。新的三环砜小分子WEHI-9625与VDAC2结合，促进其抑制小鼠BAK诱导的细胞凋亡。与caspase抑制剂相比，WEHI-9625在线粒体损伤前阻止细胞凋亡，保持细胞功能和长期克隆形成潜能。
华山论剑
提出问题：
细胞凋亡对维持组织内稳态是必不可少的，比如用小分子激活内源性凋亡途径是目前临床上有效的肿瘤治疗方法。但是如何在疾病环境中通过阻止细胞凋亡来防止健康细胞死亡？
华山论剑
研究背景：
1. 过去的研究：
主要集中在靶向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶上，（caspases是介导许多凋亡细胞死亡标志的蛋白酶）。但研究发现在哺乳动物细胞中，凋亡的caspases主要确保死亡细胞的快速清除，它们加速细胞凋亡，但不是细胞死亡所必需的。因为其在细胞凋亡中的作用太晚，无法提供长期保护。
2. 明确凋亡机理:
使细胞死亡的关键步骤是激活BAK或BAX，例如BIM等蛋白通过抑制促生存蛋白和激活BAX/BAK启动细胞凋亡导致线粒体外膜通透性（MOMP）允许细胞色素c的细胞质外排，这一事件导致凋亡caspase级联反应。
华山论剑
猜想与假设：
一个更有效的方法来阻止凋亡的药理学将是在caspase激活之前。
华山论剑
实验思路：
1. 模块一：开发和鉴定凋亡小分子抑制剂（WEHI-9625）、确定特异性功能及其作用的关键变量
2. 模块二：研究BAK的影响WEHI-9625抗凋亡活性两个区域和靶功能评价
3. 模块三：确定WEHI-9625通过增强VDAC2:BAK交互作用起作用。
华山论剑
设计实验：
实验一：有效的凋亡小分子抑制剂的鉴定和开发
1. ABT-737通过选择性地抑制BCL-XL和BCL-2，在缺乏Mcl115的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中触发BAX/bak介导的凋亡。
2. 当加入的小分子能够防止ABT-737对细胞的杀灭，则说明其能够阻止细胞凋亡和挽救克隆形成细胞存活。
3. 通过对大量化合物的筛选发现WEHI-9625在多种分析和细胞类型中显示出优越的活性，因此它被选为进一步研究的主要工具化合物。
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实验二：证明WEHI-9625选择性阻断BAK介导的小鼠凋亡。
1.鉴于ABT-737的杀伤作用是由BAX/BAK介导的，为明确WEHI-9625是否能够完全阻断由这两种蛋白驱动的细胞凋亡，科学家通过测定渗透性细胞16线粒体去极化的实验，证实其选择性阻断BAK介导的小鼠凋亡。
2.为了确定BAK自身的物种差异是否支持这种选择性：
实验过程
1）在几个人细胞系上测试WEHI-9625时，未观察到任何活性
2）用鼠BAK（mBAK）或人BAK（hBAK）重组了BAK/BAX缺陷的人HCT116细胞
结果：
在这些人细胞中，WEHI-9625阻断BIM-BH3诱导的线粒体去极化是由mBAK驱动，而非hBAK。
结论：WEHI-9625特异性地抑制了mBAK介导的凋亡。
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实验三：决定WEHI-9625是否能阻止细胞凋亡的关键变量什么？
设计实验：
BIM-BH3肽处理的Bax-线粒体BAK二聚、齐聚及细胞色素c释放的研究
结果：BAK与未处理细胞中的高分子量复合物（~400 kDa）的结合已经被证明依赖于BAK和VDAC2之间的相互作用
结论：决定WEHI-9625是否能阻止细胞凋亡的关键变量是mBAK正在驱动的这种反应。
进一步推测：WEHI-9625系列可能能够挽救细胞在凋亡应激下的长期克隆生存。
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实验四：证明WEHI-9625保持细胞功能和长期克隆形成潜能。
1）评估WEHI-9625、其活性类似物和泛caspase抑制剂Q-VD-OPh在短时间内阻断BAK驱动的细胞死亡的效果——三者同样有效
2）将这些受保护的细胞再培养6天，以评估其恢复、增殖和形成菌落的能力——存在明显的差异
结论：BAK激活的早期阻断导致克隆细胞存活。
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实验五：研究BAK的影响WEHI-9625抗凋亡活性两个区域和靶功能评价
实验二中WEHI-9625抑制mBAK而非hBAK的能力存在显著差异，我们试图确定导致这种差异的BAK区域。
设计实验：构建了一系列嵌合体变体，在其中交换保存良好的小鼠和人BAK蛋白的残基。WEHI9625的活性在每个变异体重组的Bax-/-Bak-/-MEFs中进行评估。
结果：两个离散区域影响化合物的作用能力：
1）位点A涉及跨膜结构域（α9）附近的残基
2）位点B以第一α螺旋（α1）中的残基为中心
3）WEHI-9625只能在A和B位点
实验目的：候选WEHI-9625靶的功能评价
推测：
1. 如果WEHI-9625抑制BAK功能所需的一个靶点，那么缺乏该靶点的细胞在被触发发生凋亡时应表现出BAK激活受损，而与WEHI-9625暴露无关。
2. 第二种可能性是WEHI-9625可能会导致或增强其目标抑制BAK的能力。
实验结果：在以Vdac2为靶点的独立sgRNA构建物转染的三个细胞群中，WEHI-9625未能阻止一定比例的细胞（图5a和补充图7）中BAK的激活，推测其中Vdac2缺失已成功发生。
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实验六：WEHI-9625是否需要VDAC2来阻断mBAK诱导的细胞凋亡。
设计实验：WEHI-9625及其类似物仍然是缺乏Vdac1或Vdac3的细胞中BAK介导的细胞死亡的有效抑制剂，但它们在缺乏Vdac2的细胞中完全不起作用
结果：证实Vdac2对WEHI-9625及其类似物阻断BAK介导的细胞凋亡是必要的。
问题：该实验中证实只有Vdac2对WEHI-9625及其类似物阻断BAK介导的细胞凋亡是必要的。在进行光交联，标记蛋白经TAMRA叠氮偶联后凝胶电泳观察，通过这种方法，VDAC1和VDAC2都被确认为直接靶点，VDAC1的标记似乎更强烈，这二者之间是否是相互矛盾的？
实验七：通过光交联确认VDAC1和VDAC2的接合。
实验八： 构建变异体来研究结构功能的关系
结论：文献中一系列生化实验数据表明BAK和VDAC2相互作用的界面决定了WEHI-9625能否稳定它们的相互作用，并表明这些化合物可能将mBAK与VDAC2结合在一起，以防止其活化和随后的凋亡。
推论：
WEHI-9625可以通过稳定VDAC2/mBAK复合物，使两种蛋白不能分离，将VDAC2转化为更有效的mBAK负调控因子。
验证假设：
一种新的三环砜小分子系列（WEHI-9625（1）及其类似物）通过增强VDAC2抑制mBAK功能的能力阻断细胞的内源性凋亡，并保留细胞的克隆形成潜能。说明所以，阻断线粒体损伤上游的凋亡是可行的。
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得出结论：
1. 揭示了一种有效的抑制剂，能够在mBAK引起线粒体损伤之前阻断其激活。
2. 这些抑制剂可以更好地理解VDAC2在调节mBAK中的神秘作用，
3. 可以在实验模型中评估阻断mBAK驱动的凋亡的影响。
参考文献：
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